Florey urodził się w Adelajdzie w Australii Południowej jako syn dyrektora szkoły. Uczęszczał do St Peter's College w Adelajdzie i na Uniwersytet w Adelajdzie, gdzie uzyskał tytuł licencjata w 1921 r. i stopień doktora medycyny w 1924 r.
Po uzyskaniu dyplomu lekarza Florey pracował w Instytucie Badań Medycznych Waltera i Elizy Hall w Melbourne, gdzie poznał Ernsta Chaina. W 1928 roku przenieśli się do Szkoły Patologii Sir Williama Dunna na Uniwersytecie Oksfordzkim, gdzie rozpoczęli prace nad rozwojem penicyliny.
Penicylinę odkrył w 1928 roku Alexander Fleming, ale nie udało się jej przekształcić w użyteczny lek. Floreyowi i Chainowi udało się wyizolować aktywny składnik penicyliny i oczyścić go tak, aby można go było wstrzykiwać pacjentom. Opracowali także metody masowej produkcji penicyliny, co umożliwiło jej szerokie zastosowanie podczas II wojny światowej.
Praca Floreya i Chaina nad penicyliną uratowała niezliczone życie ludzkie podczas II wojny światowej i zrewolucjonizowała leczenie chorób zakaźnych. Florey otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 1945 r., a tytuł szlachecki otrzymał w 1944 r.
Florey był także wybitnym administratorem i pedagogiem. Pełnił funkcję prorektora Uniwersytetu Oksfordzkiego od 1959 do 1962, a od 1960 do 1965 był prezesem Royal Society of London. Był także członkiem Australijskiej Akademii Nauk, Amerykańskiej Akademii Sztuki i Nauki i Narodowej Akademii Nauk.
Florey zmarł na udar w Oksfordzie w 1968 roku. Uważany jest za jednego z najważniejszych australijskich naukowców XX wieku, a jego praca nad penicyliną uratowała życie milionów ludzi.